1  反向遗传操作技术

    反向遗传学(reverse genetics)是相对经典遗传学而言的。经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律，而反向遗传学则是直接从生物遗传物质入手，通过对遗传物质进行加工和修饰来研究基因突变后产生的生物体的特性，从而确定生物体基因组的结构与功能以及这些突变可能对生物体特性的影响。与之相关的各种研究技术统称为反向遗传学技术(reversc genetics manipulation technique)。

    负链RNA病毒的反向遗传学技术是将病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对RNA病毒进行加工、修饰，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒，从而研究病毒基因组的结构和功能，病毒的转录、表达机制和致病机理等的一项研究技术，也叫全长感染性cD NA克隆技术，义称“病毒拯救”。

2  NDV反向遗传学技术 

   NDV是单股、负链、不分节段的RNA病毒，基因组大小约为15.2 kb，由3′-NP-P-M-F-HN-L-5′等6个主要基因组成。NDV的反向遗传学研究开展得相对较晚，是在参照其他单股不分节段负链RNA病毒反向遗传学技术的基础上建立起来的。NDV的第一个反向遗传学研究系统由Peeters等于1999年建立，他们分别将克隆有NDV LaSota毒株全基因组cDNA(在T7启动子下游)、NP、P以及L基因的重组质粒共转染能表达T7 RNA聚合酶的重组禽痘病毒(FPV/T7)预感染的CFF或QM5细胞，成功拯救出具有感染性的NDV。但是利用FPV/T7可能会影响病毒拯救率和易于诱导RNA重组。为此，Romer-Oberdorfer等将BSR T7/5细胞系(一种能稳定表达T7RNA聚合酶的BHK2l细胞系)引入了NDV反向遗传学研究系统，成功拯救出 NDV clone30毒株。2001年，Huang等利用人表皮样癌细胞(HEp-2)和能表达T7RNA聚合酶的重组痘病毒(MVA/T7)来拯救NDV获得了成功。MVA对HEp-2细胞具有严格的宿主特异性，在禽源细胞和鸡胚内不能增殖，不会产生CPE，也不会干扰病毒的拯救，同样解决了FPV/T7降低病毒拯救率的问题。

    NDV拯救的基本路线是将病毒基因组cDNA置于转录载体T7启动子之后、ε-肝炎病毒核酶基因和T7终止子之前构建出转录载体。同时构建表达核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的辅助表达载体。然后将转录载体和3个辅助表达载体共转染能表达T7 RNA聚合酶的痘苗病毒感染的细胞或直接能表达T7 RNA聚合酶的细胞系，细胞内表达的T7RNA聚合酶启动全长病毒基因组RNA的转录，表达载体利用宿主细胞的酶系统表达核衣壳蛋白和病毒RNA聚合酶，这些蛋白与病毒基因组RNA结合后形成具有感染性的核糖核蛋白(RNP)复合体，从而启动病毒的复制和转录，最终组装成有感染性的病毒粒子。目前报道已有LaSota，Clone30, Beaudette C, Hitchner Bl，Herts33和鹅源zJ1等6个NDV成功获得拯救。建立NDV的反向遗传操作体系主要包括转录载体和辅助表达载体的构建以及病毒拯救和鉴定等方面的内容。

2.1  转录载体的构建  转录载体足通过反转录聚合酶链式反应(RT-PcR)扩增病毒基因组片段，然后利用限制性酶切位点或重叠PCR的方法将扩增的cDNA片段按顺序相连于合适的严谨型载体上而获得的。NDV全长cDNA基因组较大，通常采用分段扩增以及减少PCR循环次数的方法来降低碱基错配率。克隆构建时大多采用复制严谨性较高的低拷贝载体，并在这类载体上加上一些其他必要元件，如T7启动子、e-肝炎病毒核酶基因、转录终止信号以及便于插入外源基因的多克隆位点等。将全长基因组cDNA置于转录载体中的T7启动子之后、e-肝炎病毒核酶撼因和T7终止子之前，同时引入两个遗传标记(用于在进一步研究中区分拯救毒株与亲本毒株)从而完成转录载体的构建。

2.2  辅助表达载体的构建  NDV基因组RNA是负链的，不能直接用作转录和复制的模板。只有当基因组RNA与NP、P、L共同形成功能性的RNP复合体后，才能被RNA依赖的RNA聚合酶识别并能作为转录和复制的模板(图1)(略)。因此必须构建NP、P、L三个辅助表达质粒。在构建辅助质粒时，NP和P基因可经RT-PCR扩增后直接连接表达质粒进行构建，L基因由于较长则需要分段克隆拼接后进行构建。

2.3  病毒的拯救及鉴定  将转录载体和3个辅助表达载体按一定的比例共转染合适的细胞，转染3d左右收获细胞悬液，离心取上清，将上清液通过尿囊腔途径接种于9～10日龄的无特定病原体(SPF)鸡胚，培养72～96h后收获尿囊液，利用血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)进行检测。尿囊液具有血凝特性并且能够被抗NDV的特异性单因子血清所抑制，证明病毒拯救成功。拯救的毒株具有亲本NDV的特性，同时含有两个和亲本病毒相区别的遗传标记，必要时可进行测序鉴定。

3  NDV反向遗传技术的应用

    利用NDV反向遗传技术可以对NDV基因的结构和功能进行有效研究，同时NDV也已经被开发成为一种常用的病毒载体。

3.1  在病毒致病机制研究中的应用  在cDNA分子水平上对NDV基因组进行加工和修饰，可以分析与NDV致病性相关的各种蛋白。1999年，Peeters等利用建立的NDV反向遗传操作系统对F蛋白裂解位点的功能进行了验证性研究。他们将NDV LaSota毒株的F0裂解位点的氨基酸序列从(¹¹²GRQGRL¹¹⁷)转变为强毒株的序列(¹¹²RRQRRF¹¹⁷)时病毒毒力显著增强。表明F蛋白裂解位点序列与NDV的毒力有密切关系。

    Mebatslon等(2001)采用反向遗传技术构建了Clone30的感染性分子克隆，并据此构建了3个突变株：NDVPl(NDV P基因保守序UUUUUCCC突变为UUCUUCCC)、NDV△6(V区缺失6个碱基)、NDV-Vstop(V区加入终止密码子)。与亲本毒相比，NDVP1突变体V蛋白的表达量下降20倍，在鸡胚上的产量降低100倍。NDV△6、NDV-Vstop中的突变则可导致V蛋白的产生彻底停止，突变株不能在鸡胚上进行复制。研究结果表明V蛋白对NDV的复制是必需的。

    Angela等(2003)利用反向遗传技术证实HN基因的不同长度与NDV的毒力和致病性有着非常重要的关系。2005年，de Leeuw等在获得强毒株Herts/33感染性克隆FL-Herts的基础上，将它与NDFLtag(LaSota的F0蛋白切割位点序列变成强毒株的序列)进行了一系列基因替换。重组病毒NDFLtag(HN)^Herts(NDFLtag的HN基因被强毒株Herts/33的HN基因替换)的脑内接种致病指数(ICPI)和静脉内接种致病指数(IVPI)均较亲本毒NDFLtag显著升高，同样说明HN蛋白是影响NDV致病力的重要蛋白。

    Wakamatsu等(2006)在鸡体内进一步研究了F、HN以及P蛋白与NDV致病力的关系。他们对rBC LaSotaHN(中等毒力毒株Beaudette C的HN基因被LaSota株替换)、rLaSota BCHN(LaSo-ta株的HN基因被Beaudette C株替换)、rLaSotaVF BCHN(LaSota株F0蛋白裂解位点序列变为强度株裂解位点得到重组毒株rLaSotaVF的HN基因被Beaudette C株替换)、rBC/V-Stop(不表达V蛋白)和rBC/Edit(V蛋白和W蛋白都不表达)的致病性变化进行了测定和分析，结果表明不仅F蛋白和HN蛋白是NDV致病力的重要分子基础，HN蛋白与F蛋白的相互作用对NDV的致病力影响也较大。研究结果还进一步表明P基因编码的两个蛋白V和W也均与NDV的致病力相关。

    NDV反向遗传研究系统的建立极大地促进了NDV致病机制的研究。前人通过将NDV的HN、F、P基因编码区进行点突变、基因片段替换等已初步确定了NDV中HN、F、P等基因与致病机制的关系。但关于NDV致病机制方面仍有许多未知因素亟需探索和研究。

3.2  在病毒载体研究中的应用  Krishnamurphy等(2000)将氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)插入到中等毒力毒株Beaudette C株HN基因和L基因之间。与亲本株相比，重组病毒虽然在鸡胚成纤维细胞(CEF)上的复制速度和产量均有所下降，但该重组病毒在传了8代后仍能稳定表达CAT，结果表明NDV可以作为外源基因的表达载体。

    Engel-Herhert等(2003)把绿色荧光蛋白(GFP)基因插入新城疫病毒CLone30毒株基因组的F基因和HN基因之间获得了重组病毒rNDV-GFPl。rNDV-GFPl在鸡胚中可稳定表达GFP，并且其在鸡胚中的增殖能力以及对鸡胚的致病性与亲本Clone30毒株均无明显区别。利用GFP的自发荧光特性，可以很容易的在器官和组织中发现感染的细胞，因此能够更清楚地了解NDV在体内的分布情况，显示了NDV作为疫苗载体的巨大潜力。

    Zhao等(2003)对NDV作为载体的可行性进行了深入研究。他们将碱性磷酸酶基因(SEAP)分别插入NDV病毒的NP-P、M-F、HN-L、基因组5′端，结果除了基因组5′端这个位置，SEAP被插入前三个位置，无论是在细胞上还是在鸡胚上都能得到高效表达且活性不受影响。从外源基因插入NDV的位置来看，其插入位置越接近NDV基因组的3′末端，其病毒蛋白表达水平有可能越高。

3.3  在新型疫茁研究中的应用  2001年，Nakaya等把流感病毒A/WSN/33的HA基因插入到NDV弱毒株Hitchner B1基因组的P基因和M基因之间，获得了含有流感病毒HA基因的重组新城疫病毒rNDV/Bl-HA。rNDV/B1-HA在鸡胚连续传10代后仍能稳定地表达流感HA蛋白。动物实验亦显示重组rNDV/B1-HA对小鼠没有毒性，而且能保护小鼠免受A/WSN/33的致死性攻击。

    2004年，Huang等采用体内复制能力较强、免疫原性良好的LaSota疫苗株为载体，构建了表达传染性囊病病毒(IBDV)变异株GLS-5 VP2基因的重组新城疫病毒rLaSota/VP2，利用该重组株免疫2日龄SPF雏鸡可有效抵御IBDV变异株及新城疫强毒的攻击，保护率均达到100%。

    2009年，胡顺林等利用反向遗传技术将NDV强毒株ZJ1的F裂解位点序列进行改造，成功拯救出重组毒株NDV/ZJ1HN。利用NDV/ZJ1HN免疫2周龄鸡，免疫后4周用基因Ⅶ型NDV强毒株进行攻毒可获得比传统疫苗LaSota株更好的免疫保护，提示NDV/ZJlHN有可能作为一个理想候选疫苗株用于生产中对基因Ⅶ型NDV流行株的防控。

    Nayak等(2009)将H5N1高致病性禽流感病毒A/Vietnam/1203/2004的血凝素(HA)基因插入到NDV LaSota株中，获得了含有禽流感病毒HA基因的重组新城疫病毒rNDV-HA，利用rNDV-HA免疫14日龄SPF雏鸡，免疫后3周对新城疫强毒及H5N1亚型禽流感病毒均具有较好的保护。

    NDV在人用活载体疫苗中也有应用。Di-Napoh等(2007)将SARS-CoV的S蛋白插入NDV弱毒株的P-M位点，证实其在灵长类动物中具有较好的免疫原性和保护性，是一种非常有潜力的疫苗载体。

4  现状与展望

    NDV反向遗传技术的研究既有利于NDV结构和功能的研究，又有利于新型基因工程疫苗的研制。尽管NDV拯救工作难度相对较大，近年NDV的反向遗传学相关研究仍取得了许多骄人的成绩，相信随着反向遗传学技术的进一步发展与完善，其在NDV等重大动物疫病的致病机理及预防控制等方面将会取得更大的成绩。