推荐的标准试验组合中的遗传毒性试验方法
注：以下方法中所提供的最高浓度和最高剂量设计原则主要针对化学药物，中药、天然药物由于情况复杂，应综合考虑多方面因素，不能简单套用该原则，试验时应根据具体情况进行合理的设计。
（一）细菌回复突变试验（Bacterial reverse mutation test）
1、菌株
组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌和/或色氨酸营养缺陷型埃希氏大肠杆菌，至少应包含下述五种菌株组合（除特殊说明外，均为鼠伤寒沙门氏菌）：
（1）TA98；（2）TA100；（3）TA1535；（4）TA1537或TA97或TA97a；（5）TA102或大肠埃希杆菌WP2 uvrA或大肠埃希杆菌WP2 uvrA（pKM101）。
菌株特性鉴定需符合要求，-80℃或液氮冻存备用。
2、浓度
至少应包含5个可用于结果分析的浓度。
最高浓度主要取决于受试物对细菌的毒性和/或溶解度：
a、对于可溶性的无毒受试物，推荐的最高测试浓度一般为5mg/皿；
b、对于可溶性的有细菌毒性的受试物，应根据杀菌或抑菌情况确定最高浓度（详见正文1.2.2）；
c、对于难溶性的受试物，一般采用最小沉淀浓度为最高浓度；若观察到浓度相关性的细胞毒性或诱变性，则要求检测多个产生沉淀的浓度（详见正文1.2.3）。
3、代谢活化
一般采用诱导剂，如Aroclor 1254或苯巴比妥和β-萘黄酮联合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验，即在加S9和不加S9平行条件下测试。S9在S9混合液中的浓度一般为5～30％（v/v）。
4、对照
代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性（空白对照和/或溶剂对照）和阳性对照组。阳性对照物应为已知的菌株特异性的阳性致突变剂。
5、方法
可采用标准平板掺入法或预培养法，受试物处理后48～72小时观察结果。每一浓度至少平行三皿。实验至少重复一次。
6、结果判定
结果中应描述各浓度组细菌毒性大小和沉淀情况，结果表示为每皿的回复突变菌落数，并计算各组的均值和标准差。
至少在一个菌株上，在有或无代谢活化的情况下，受试物所诱发的回复突变菌落数出现浓度依赖性的增加和/或在一个或多个浓度组上出现可重复性的增加，可判定为阳性结果。结果判定时应首先考虑试验结果的生物学意义，统计学方法有助于对结果的评价，但是统计学意义不是阳性反应的唯一标准。
（二）体外哺乳动物细胞染色体畸变试验（In vitro Mammalian chromosomal aberration test）
1、细胞
可采用哺乳动物或人的细胞进行试验，如CHL细胞、CHO细胞、人外周血淋巴细胞等，细胞系需定期检查核型和有无支原体污染等。-80℃或液氮冻存备用。
2、浓度
至少应包含3个可用于结果分析的浓度。
最高浓度主要取决于受试物的细胞毒性和/或溶解度，中、低浓度一般采用倍比稀释法：
a、对于可溶性的无毒受试物，推荐的最高测试浓度一般为5mg/ml或10mM（选用较低者）；
b、对于可溶性的有细胞毒性的受试物，应根据细胞毒性大小确定最高浓度，如通过活细胞计数、细胞融合率或有丝分裂指数等确定，一般毒性应大于50％（详见正文1.2.2）；
c、对于难溶性的受试物，一般采用最小沉淀浓度为最高浓度；若观察到浓度相关性的细胞毒性或诱变性，则要求检测多个产生沉淀的浓度（详见正文1.2.3）。
3、代谢活化
一般采用诱导剂，如Aroclor 1254或苯巴比妥和β-萘黄酮联合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验，即在加S9和不加S9平行条件下测试。S9在试验介质中的终浓度一般为1～10％（v/v）。
4、对照
代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性（空白对照和/或溶剂对照）和阳性对照组。阳性对照物应为已知的阳性致突变剂。
5、方法
处理及细胞收获时间：在代谢或非代谢活化的情况下，受试物和细胞作用3～6小时，在1.5个细胞周期时收获细胞。若均得到阴性结果，需在非代谢活化条件下，受试物和细胞应持续作用至1.5个细胞周期时收获细胞。对某些受试物与细胞接触时间/收获细胞时间可能要大于1.5个细胞周期。
读片分析：一般油镜下每种浓度至少观察200个分散良好的中期分裂相细胞，若观察到大量染色体畸变细胞，分析细胞数可相应减少。应分别记录各组含有结构畸变染色体的细胞数和畸变类型，裂隙应单独记录，但不计入畸变率中。同时应单独记录多倍体和内复制等数目畸变，但不计入畸变率中。
6、结果判定
结果中应描述各浓度组细胞毒性大小和沉淀情况，结果表示为染色体结构畸变细胞的百分率。
受试物所诱发的染色体畸变率出现浓度依赖性的增加，或出现可重复性的增加，可判定为阳性结果。结果判定时应首先考虑试验结果的生物学意义，统计学方法有助于对结果的评价，但是统计学意义不是阳性反应的唯一标准。
多倍体数目的增加提示受试物可能会抑制有丝分裂或诱导染色体数目畸变。出现染色体内复制的细胞数增多提示受试物可能会影响细胞周期。
（三）小鼠淋巴瘤细胞试验（Mouse lymphoma assay，MLA）
1、细胞
通常采用小鼠淋巴瘤L5178Y tk+/- -3.7.2 C细胞，需定期检查核型或有无支原体污染等，必要时进行自发突变细胞的清除。-80℃或液氮冻存备用。
2、浓度
至少应包含4（平行处理）～8（单处理）个可用于结果分析的浓度。
最高浓度主要取决于受试物的细胞毒性和/或溶解度，中、低浓度一般采用倍比稀释法：
a、对于可溶性的无毒受试物，推荐的最高测试浓度一般为5mg/ml或10mM（选用较低者）；
b、对于可溶性的有细胞毒性的受试物，应根据细胞毒性大小确定最高浓度，如通过评价平板接种效率或相对总生长率确定细胞毒性，最高浓度应能产生至少80%毒性（即存活率不大于20%）。对于细胞存活率低于10%的阳性结果，应谨慎对待（详见正文1.2.2）。
c、对于难溶性的受试物，一般采用最小沉淀浓度最为最高浓度；若观察到浓度相关性的细胞毒性或诱变性，则要求检测多个产生沉淀的浓（详见正文1.2.3）。
3、代谢活化
一般采用诱导剂，如Aroclor 1254或苯巴比妥和β-萘黄酮联合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验，即在加S9和不加S9平行条件下测试。S9在试验介质中的终浓度一般为1～10％（v/v）。
4、对照
代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性（空白对照和/或溶剂对照）和阳性对照组。阳性对照物应为已知的阳性致突变剂。
5、方法
一般采用微孔法进行试验。
药物处理时间：在代谢活化或非代谢活化条件下，一般受试物与细胞作用3～4小时。如果受试物作用3～4小时后结果为阴性，还需进行在无代谢活化条件下作用24h的附加试验进一步确定。
突变表达期：受试物与细胞作用3～4小时后，去除受试物，将细胞重悬于培养液中，一般L5178Y细胞的突变表达期为2天，分别在处理结束后及表达期结束后测定平板接种效率以确定细胞毒性。
突变率测定：表达期结束后，将细胞接种于含有突变选择剂三氟胸苷（TFT）的96孔板中进行TFT抗性突变集落的测定。如果受试物出现阳性结果，则至少有一个受试物浓度组（一般为最高浓度）和阴性、阳性对照组需要分别记录含有大、小集落的孔数；如果为阴性结果，仅阴性和阳性对照组需要分别记录含有大、小集落的孔数。
6、结果判定
结果中应描述各浓度组细胞毒性大小和沉淀情况，结果表示为各浓度组的突变率。
如果一个或多个浓度组出现浓度依赖性和/或可重复性的突变率增加，则判定为阳性结果。结果判定时应首先考虑试验结果的生物学意义，统计学方法有助于对结果的评价，但是统计学意义不是阳性反应的唯一标准。
如果出现明确的阳性结果，则不需要重复试验；如果出现可疑结果则需要重复试验；如果代谢活化条件下为阴性结果，可依据具体问题具体分析的原则考虑是否需要重复试验，若不进行重复试验时需说明理由。在重复试验中，可以考虑改变剂量间距或代谢活化条件。
（四）哺乳动物体内微核试验（Mammalian erythrocyte micronucleus test）
1、动物
骨髓试验通常采用小鼠和大鼠，如合适也可选用其他哺乳动物。检测外周血时推荐采用小鼠。但是如果是脾无法清除带微核的红细胞的种属，或已证明用于检测可引起结构和/或数目的染色体畸变的药物有足够敏度的种属也可使用。
采用健康性成熟动物，建议采用雄性，每组至少6只。若性别间存在明显的毒性或代谢方面的差异，则应采用两种性别的动物，每组雌雄至少各5只。如果受试物专用于一种性别，则通常选用相应性别的动物进行试验。起始试验时，动物体重差异应在各性别平均体重的20％之内。
2、剂量
至少应设置3个剂量组，根据相关毒性试验或预试验的结果确定高剂量，高剂量应产生一定的毒性症状或骨髓毒性（如嗜多染红细胞在红细胞总数中的比例降低）。对于低毒性化合物，给药时间≤14天的推荐最高剂量为2000mg/kg/d，给药时间>14天的推荐最高剂量为1000mg/kg/d；对于单次给药或一天内多次给药达2000mg/kg/d仍无毒性的化合物，设置3个剂量组的意义不大。
3、对照
应设立平行阴性（空白对照和/或溶剂对照）和阳性对照组。阳性对照物应为已知的阳性致突变剂。
4、方法
给药方案：根据具体情况选择合适的给药方案，可采用单次给药（或24小时内多次给药）或重复给药。受试物的给药途径应尽可能与临床拟用途径相同，阴性对照物必须与受试物给药途径一致，阳性对照物的给药途径可以不同于受试物。
骨髓采样时间：如果采用单次给药，至少应采样2次，骨髓采样时间应在给药后24～48小时内，外周血采样时间应在给药后36～72小时内。受试物第一个采样点应至少包括3个剂量组，第二个采样点可仅包括高剂量组。
如果采用重复给药，可只采样1次，骨髓采样时间应在末次给药后18～24小时，外周血采样时间应在末次给药后36～48小时。
镜检：每只动物至少计数200（骨髓）或1000（外周血）个红细胞以确定嗜多染红细胞（PCE）和总红细胞（嗜多染红细胞和正染红细胞（NCE））的比例；至少计数2000个嗜多染红细胞以判断嗜多染红细胞的微核率。给药组嗜多染红细胞和总红细胞的比例不应低于对照组的20％。如果给药时间在4周以上，可以直接计数2000个红细胞中的微核率。
5、结果判定
结果中应描述各剂量组的毒性大小，包括一般症状和PCE/（PCE+NCE）的比例，结果表示为各剂量组的嗜多染细胞微核率（MNPCE）。
受试物所诱发的微核率出现有剂量依赖性的升高，或某一剂量组在某一测试点呈现可重复性的明显升高，可判定为阳性结果。结果判定时应首先考虑试验结果的生物学意义，统计学方法有助于对结果的评价，但是统计学意义不是阳性反应的唯一标准。
如果出现可疑阳性时需重复试验以确证结果，在重复试验中可考虑改变试验条件。